انواع میکروسکوپ

انواع میکروسکوپ

 میکروسکوپ فاز متضاد

    در سال‌های اخیر پیشرفت‌های قابل ملاحظه‌ای در مطالعه سلول‌های زنده از راه ابداع ابزارهای نوری خاص و کاربرد آنها مثل میکروسکوپ فازمتضاد و میکروسکوپ تداخلی حاصل شده است. اسا این دو روش بر این اساس است که ساختمان‌های زیستی از نظر فیزیکی به این دلیل شفافیت دارند که تغییر فاز چندانی در پرتوهایی که از آنها می‌گذرد ایجاد نمی‌کنند. برای روشن شدن طرز عمل میکروسکوپ فازمتضاد، بایستی وضع یک شعاع نورانی را که از محیط شفافی با ضریب شکست تقریبا مشابه با محیطی میگذرد را بررسی کرد (چنین وضعی در مورد سلول‌های زنده صدق می‌کند). این جسم به هر مانعی برای عبور شعاع نورانی خواهد بود. بخشی از شعاع نورانی، بدون پراش از جسم می‌گذز، e و d شدت و طول موجش تغییر نمی‌کند. بخش دیگری از همین شعاع نورانی تفراق پیدا می‌کند و نسبت به شعاع‌هایی که از جسم نمی‌گذرد انحرافی پیدا می‌کند. در مورد مواد زیستی، اختلاف فاز موجود بین امواج نگذشته از جسم و امواج پراش یافته بوسیله جسم تقریبا است. این دو شعاع نورانی وارد عدسی ابژکتیف شده و تداخل پیدا می‌کنند. شعاعی که از این تداخل نتیجه می‌شود دارای طول موج و دامنه یکسان با موجی است که از محیط می‌گذرد، اما نسبت به آن تأخیر یا تغییر فاز مختصری دارد. این تأخیر برای ایجاد تغییر دامنه به آن حد که با میکروسکوپ نوری معمولی قابل تشخیص باشد نیست و حتی در میکروسکوپ نوری معمولی نیز چنین پدیده‌ای صورت می‌گیرد.

    میکروسکوپ فاز متضاد که بوسیله زرنیک در 1934 ابداع شد، امکان می‌دهد که اختلاف فازهای کوچک را تشدید کرده (و بنابراین شدت آنها را زیاد کنیم) و در نتیجه تشخیص آنها به وسیله چشم یا صفحه عکاسی را امکان‌پذیر سازیم. در میکروسکوپ فاز، جانبی‌ترین نوری که از ابژکتیف می‌گذرد، به اندازه  از نوری که از مرکز ابژکتیف عبور می‌کند، تأخیر یا تقدم فاز دارد. به منظور ایجاد این اختلاف فاز، در سطح کانونی پشتی ابژکتیف، یک صفحه حلقوی فاز و بعد در محل کوندانسور، یک دیافراگم حلقوی قرار داده می‌شود. صفحه فاز، صفحه‌ای شفاف است که دارای یک برآمدگی یا یک گودی است، ابعاد و شکل آن با تصویر مستقیم کوندانسوری که در زیر پلاتین قرار گرفته است مطابقت دارد.

    تضاد از تداخل بین تصویر هندسی مستقیمی که بوسیله بخش مرکزی ابژکتیف ساخته شده و تصویر جانبی تفرق یافته‌ای که به اندازه  تأخیر یا تقدم داشته است، صورت می‌گیرد. در حالت تضاد منفی (تضاد درخشنده) انرژی دو دسته جمع می‌شود و جسم خیلی روشن‌تر از زمینه به نظر می‌رسد. در حالت تضاد مثبت (تضاد تیره) انرژی دو دسته از هم کم می‌شود و در نتیجه تیره‌تر از زمینه دیده می‌شود. پدیده تداخل به منظور تشدید تغییرات جزئی در محل ابژکتیف و تبدیل آن به تغییرات دامنه (شدت) است. با این روش، جسم شفاف به حسب ضخامتش و با اختلافی که از نظر ضریب شکستش با محیط دارد، به رنگ خاکستری دیده می‌شود.

 میکروسکوپ تداخلی

    میکروسکوپ تداخلی، از نظر طرز عمل اصول مشابهی با میکروسکوپ فازمتضاد دارد، با این برتری که به کمک آن اطلاعات کمی (مقداری) را نیز می‌توان بدست آورد. به کمک این دستگاه می‌توان اختلاف فاز نوری ساختمان‌های مختلف سلولی را مشخص کرد، و در نتیجه وزن خشک نسبی آنها را سنجید. علاوه بر این، میکروسکوپ تداخلی امکان می‌دهد که تغییرات جزئی و ممتد ضریب شکست را مشخص سازیم در حالی که میکروسکوپ فازمتضاد تنها ضریب شکست‌های ناپیوسته را آشکار می‌سازد. در میکروسکوپ‌های تداخلی، تغییرات فاز بوسیله تغییرات رنگ و تا آن حد مشخص می‌شوند که سلول زنده ممکن است شبیه سلولی تثبیت و رنگ‌آمیزی شده به نظر برسد.

    نوری که بوسیله یک منبع واحد ایجاد شده و به دو بخش تقسیم می‌گردد. یک دسته از شعاع‌های نورانی از جسم می‌گذرند و دسته دیگر بدون عبور از جسم وارد دستگاه می‌شوند. سپس این دو دسته اشعه همدیگر را تلاقی کرده و همانند آنچه در میکروسکوپ فازمتضاد صورت می‌گیرد تداخل پیدا می‌کنند. اشعه‌ای که از جسم عبور کرده و متحمل تغییر فازی شده و نسبت به اشعه مستقیم دارای تأخیر می‌شود. مانند آنچه که در میکروسکوپ پلاریزان صورت می‌گیرد، این تأخیر (r) به ضخامت جسم (t) و اختلافی که بین ضریب شکست جسم ( n) و ضریب شکست محیط ( n) وجود دارد وابسته است و به این ترتیب وقتی مقدار n مشخص باشد، می‌توان مقدار n را بدست آورد. با میکروسکوپ تداخلی می توان ضخامت جسم ، تراکمش از ماده خشک و مقدار آب آن را همزمان با هم و با        اندازه‌گیری‌های پیوسته اختلاف فاز نوری در دو محیط که ضریب شکست آنها مشخص است، اندازه‌گیری کرد.

 میکروسکوپ زمینه تاریک

    اساس ساختمان این میکروسکوپ همانند یک میکروسکوپ نوری معمولی است با این تفاوت که دیافراگم کوندانسور آن به نحوی ساخته شده که بخش میانی آن غیر شفاف و مانع عبور پرتوهای نوری مرکزی است و نور تنها از کناره‌های دیافراگم و به‌طور مایل به جسم می‌تابد. با استفاده از این دیافراگم: الف- زمینه رؤیت میکروسکوپ تاریک می‌شود. ب- از پرتوهای محیطی که به‌طور مایل به جسم می‌رسد، تنها بخش پراش یافته بوسیله سطح جسم وارد ابژکتیف می‌شود و تصویر را به وجود می‌آورد . هیچ پرتویی که مستقیما از جسم بگذرد وارد ابژکتیف نخواهد شد. با این میکروسکوپ می‌توان برخی از ساختمان‌هایی که ابعادشان پایین‌تر از حد میکروسکوپ معمولی است رؤیت یا عکسبرداری کرد (اولترامیکروسکوپی) کاربرد این میکروسکوپ بیشتر برای مطالعات ریخت‌شناسی و برخی حرکات یا اندامک‌های سلولی است. چون پرتوها در رسیدن به سطح جسم پراش می‌یابند، بنابراین جزئیات ساختمان درونی یا اندامک‌های آن مشخص نخواهد شد. در سلول‌های کشت شده که با میکروسکوپ زمینه تاریک بررسی می‌شوند، هستک، پوشش هسته، میتوکندری‌ها و ذرات لیپیدی، درخشان به نظر می‌رسند در حالی که زمینه سیتوپلاسم تیره می‌ماند.

 میکروسکوپ پلاریزان

    برای بررسی ساختمان‌های زیستی آنیزوتروپ (وقتی تراکم اتم‌ها و مولکول‌های تشکیل دهنده جسمی در جهات مختلف آن همگن باشد، جسم را آنیزوتروپ نامند) که خاصیت انکسار مضاعف نور دارند، مثل سلول‌های عضلانی ، فیبرهای کلاژنی، فیبرهای گیاهی از این میکروسکوپ استفاده می‌شود.

    دارای دو قطعه مخصوص است که آنها را قطبی کننده(پلاریزور) و تجزیه کننده(آنالیزور) نامند که ممکن است از یک لایه فیلم پلاروید یا از یک منشور نیکل ساخته شده باشند. قطبی‌کننده، در زیر کوندانسور قرار گرفته و نور قطبی شده را به خط مستقیم به جسم می‌فرستد. آنالیزور در لوله میکروسکوپ و در بالای عدسی ابژکتیف قرار دارد و با جابه‌جا کردن آن می‌توان سطح یا جهت قطبیتش را به جهت پلاریزور تغییر داد. وقتی آنالیزور به اندازه 360 درجه چرخانده شود، میدان دید میکروسکوپ در ههر چرخش 180 درجه‌ای به تناوب روشن و تیره می‌شود. اگر سطح دو صفحه موازی باشد حداکثر مقدار نور وارد ابژکتیف می‌شود و میدان دید روشن می‌گردد و اگر دو سطح عمود برهم باشند هیچ نوری وارد ابژکتیف نمی‌شود و میدان دید تاریک می‌شود. اگر روی پلاتین که در این میکروسکوپ‌ها چرخان است نمونه‌ای قرار دهیم که قدرت انکسار نور را داشته باشد جهت قطبیت به حسب تأخیری که بوسیله جسم  ایجاد می‌شود منحرف خواهد شد. حالت متداول کار با میکروسکوپ پلاریزان بر این بناست که نمونه را به اندازه‌ای بچرخانیم که در میدان دید میکروسکوپ نقاط روشنایی ماکزیمم و مینیمم بدست آید. وقتی محور قطبیت جسم مورد بررسی زاویه 45  درجه با محورهای پلاریزور و آنالیزور بسازد، روشنایی ماکزیمم حاصل می‌شود. این میکروسکوپ به طور غیر مستقیم به منظور برخی تحلیل‌های فراساختمانی سلول به‌کار می‌رود.

 میکروسکوپ با پرتوهای فرابنفش

    پرتوهای فرابنفش از پرتوهای دارای طول موج کوتاه (150-250A^o) هستند که با چشم انسان قابل رؤیت نمی‌باشند. با توجه به فرمول آبه در مورد توان تفکیک میکروسکوپ‌ها استفاده از این پرتوهای فرابنفش که طول موج کوتاه‌تری از پرتوهای مرئی دارند، توان تفکیک را بهبود می‌بخشند، ولی این پرتها مخرب کشنده سلول‌های زنده، اندامک‌ها و اجزای سلولی هستند به همین جهت بیشتر از آنها در ایجاد فلوئورسانس و در روش‌های ایمونوسیتوشیمی استفاده می‌شود. وقتی برخی از اتم‌ها بوسیله محرکی از جمله پرتوهای دارای طول موج کوتاه مثل پرتو فرابنفش تحریک شود ممکن است الکترون‌ها تحریک و پرانرژی شده از مدار خود خارج شوند، ولی نیروی ججاذبه هسته از فرار الکترون ممانعت خواهد کرد. برای آنکه الکترون‌های تحریک شده بتوانند به مدار خود بازگردند باید مقداری از انرژی را که گرفته‌اند، از دست بدهند، چنانچه انرژی از دست داده شده به حد طول موج‌های مرئی برسد پدیده فلوئورسانس صورت گرفته و جسم فلوئورسانس شده است (فلوئورسانس اولیه). برخی ترکیبات لیپیدی، موم‌ها و یا کراتین فلوئورسانس اولیه دارند. اما اغلب ترکیبات سلولی فلوئورسانس اولیه ندارند ، در این حالت برای درخشان کردن آنها از ترکیبات رنگی مختلفی به اسم فلوئوروکروم‌ها استفاده می‌شود.وقتی جسمی با کمک این مواد و تحت تأثیر پرتوهای فرابنفش درخشان شود فلوئورسانس ثانیه ایجاد شده است. به حسب نوع جسم، نوع فلوئوروکرم و طول موج پرتوهایی که به جسم تابانیده می‌شود، نوع و شدت فلوئورسانس متفاوت است و به همین دلیل می‌توان ترکیب‌های مختلف سلولی را با رنگ‌های فلوئورسانس کننده اختصاصی و نوع فلوئورسانسشان جایابی و شناسایی کرد. به منظور تشخیص اجزای اسکلت سلولی، گیرنده‌های سطح سلول‌ها، تشخیص پادتن‌ها و پادگن‌ها و حتی تشخیص‌ها دقیق‌ در آسیب‌شناسی از میکروسکوپ‌های فرابنفش استفاده می‌شود. اساس ساختمان میکروسکوپ فرابنفش و فلوئورسانس شبیه میکروسکوپ نوری معمولی است با این تفاوت که به جای لامپ معمولی، پرتوهای فرابنفش به کمک لامپ جیوه‌ مخصوصی پس از رسیدن به گرمای مناسب تأمین می‌شود. به علاوه عدسی‌ها از نوع کوارتز هستند. به منظور جلوگیری از تابش پرتوهای فرابنفش به چشم شخص بیننده، در مسیر پرتوها پس از تابش آنها به جسم و ایجاد حال فلوئورسانس، فیلترهایی قرار می‌دهند که از عبور پرتوهای فرابنفش جلوگیری می‌کند.